O kultivácii in vitroMichal Parvanov, 2004
Doslovný preklad "in vitro" znamená "v skle." Explantátová kultúra in vitro teda znamená kultiváciu rastlinných explantátov v umelých (riadených a sterilných) podmienkach, kde sú deje prebiehajúce v rastlinných bunkách a ich častiach ovplyvňované až úplne riadené. Rastlinný explantát je časť rastlinnej bunky, celá bunka, skupina buniek, pletivo, časť alebo celý rastlinný orgán,... Technológie in vitro poskytujú teoreticky neobmedzené možnosti propagácie rastlín, ale navyše nám umožňujú uplatniť aj techniky v podmienkach in vivo neštandardné i nemožné. Základom in vitro kultúry je kultivačná nádoba s kultivačným médiom, obsahujúca rastlinný explantát. Všetko vovnútri nádoby je sterilné. Riadené je osvetlenie (intenzita, kvalita, dĺžka), teplota, prísun biogénnych prvkov a ich množstvo, osmotický tlak, hladiny hormónov a teda hormonálne riadené procesy, ... Sledovaný proces dosahujeme aj (hlavne) typom (pôvodom) explantátu. Nasledujúce riadky podávajú základné informácie o prevádzaní najbežnejších laboratórnych úkonov in vitro kultivácie po technickej stránke.
 Cephalotus follicularis in vitro Pracovný priestor laboratória štandardne tvoria tri miestnosti: Prvá miestnosť, to je priestor, v ktorom prebieha príprava a sterilizácia kultivačných médií, sterilizácia nástrojov a ostatných pomôcok. Táto miestnosť slúži aj ako sklad chemikálií a používaných zariadení. Ďalšou miestnosťou je malá miestnosť s flow boxom, kde prebieha sterilizácia, zavádzanie rastlinného materiálu do kultúr in vitro a jeho pasážovanie na čerstvé, prípadne iné kultivačné médiá. Činnosť v tejto miestnosti je na sterilitu prostredia najnáročnejšia, preto je vybavená aj UV žiaričom. Poslednou miestnosťou je kultivačná miestnosť. Je plne automatizovaná. 16 hodinovú fotoperiódu riadi časový spínač a teplota je regulovaná na 25° C pomocou klimatizačného zariadenia s digitálne ovládaným termostatom. Kultivačné nádoby sú umiestnené na polykarbonátových policiach a vystavené osvetleniu špeciálnych žiariviek. Technické vybavenie laboratória Najdôležitejším technickým prístrojom laboratória je flow box. Je to aseptický laminárny box, teda jeho vnútorné prostredie je pri správnej starostlivosti sterilné. Vzduch je sterilizovaný filtráciou cez hepa filter, ktorý má menšie póry ako je veľkosť potenciálne kontaminujúcich patogénov. Hepa filter s označením H 14 odfiltruje častice od veľkosti 0,3-0,5 µm s pravdepodobnosťou odlučiteľnosti 99,999 %. Hepa filter s označením H 13 odfiltruje častice od veľkosti 0,3-0,5 µm s pravdepodobnosťou odlučiteľnosti 99,997 %. Je však asi o tretinu lacnejší. Prúdenie vzduchu cez hepa filter zabezpečuje výkonný ventilátor a je laminárne, teda rovnomerné po celej ploche. To je dôležité preto, aby nevznikali spätné prúdy vzduchu, ktoré by vnášali patogény do pracovného priestoru. Flow box je vybavený UV žiaričom, ktorý sa zapína cca hodinu pred začatím práce a takisto sterilizuje prostredie. Kontaminácii dýchaním do vnútorného priestoru flow boxu bráni transparentná plastová doska.  Flow box pripravený na prácu Ďalšie prístroje: Digitálny pH meter: určuje presné pH pripravovaného kultivačného média; Nastaviteľná pipeta: možnosť vopred nastaviť pipetované množstvo látky urýchľuje prácu; Autokláv, prípadne Teplovzdušný sterilizátor: slúži na sterilizovanie nástrojov a kultivačných médií zahriatím na 120° C. V jeho príslušenstve je teplomer, nastaviteľný termostat a nastaviteľný časový spínač; Chladnička: jej funkciou je udržiavať v chlade fytohormóny, ktoré by sa v teple rozkladali, jarovizácia semien tiež prebieha v chladničke; Klimatizačné zariadenie v kultivačnej miestnosti má za úlohu udržiavať ideálnu teplotu pre rast rastlín v in vitro kultúrach. 25° C je udržiavaných pomocou digitálneho termostatu; Osvetlenie kultivačnej miestnosti: Trubicové žiarivky, ktorých chod riadi nastavený časový spínač na fotoperiódu 16/8. Podľa mojich skúseností je pre rast rastlín najvhodnejšie, čo sa týka svetelného spektra (v kompromise s cenou žiariviek), používať trubice Phillips TLD 54 a Phillips TLD 830 v kombinácii 3:1; Laboratórne váhy: veľmi presné digitálne laboratórne váhy sú jednou zo základných podmienok správneho zloženia látok v kultivačnom médiu.  Autokláv  Autokláv s kladkovým žeriavom používaný v minulosti Laboratórne sklo: Kadičky rôznej veľkosti (50, 100, 250, 500, 1000 ml); odmerné valce; rôzne typy kultivačných nádob (zaváracie poháre objemu 0,1 - 0,3 l), ktorých uzáver je perforovaný a otvor upchatý molitanom, čo je dôležité z hľadiska výmeny vzduchu v kultivačnej nádobe, vyparovania prebytočnej vody a vyrovnávania tlaku vzduchu; Petriho misky; Erlenmayerove banky; plastové kultivačné nádoby; membránové filtre na sterilizáciu fytohormónov a vitamínov; Ďalej používame liehové kahany, pinzety, nožničky, preparačné ihly, skalpely, ... Kultivačné nádoby, nástroje a pomôcky umývame vo vode s prídavkom saponátu, hneď po opláchnutí v "štandardnej" vode ich opláchneme vo vode destilovanej, lebo vápnik a iné soli vyzrážané na stenách nádob by nám skresľovali zloženie média. Nádoby a nástroje sterilizujeme zabalené v alumíniovej fólii v teplovzdušnom sterilizátore pri teplotách 160° C i vyšších. Ako kultivačné nádoby používame Petriho misky; Erlenmayerove banky; sklenené fľaše so širokým hrdlom, určené pôvodne napríklad na sterilizáciu a uchovávanie potravín; široké skúmavky; sklenené fľaše so zabrúseným uzáverom; rôzne plastové nádoby. Dôležité je, aby bol uzáver aspoň minimálne priepustný pre plyny. Ak je kovový, perforujeme ho a otvor upcháme molitanom. Ak používame gumené zátky, otvory v nich upchávame vatou. Najvhodnejšie sú transparentné plastové uzávery, ktoré nevrhajú na explantát nežiadúci tieň. Materiál však musí byť taký, aby sme ho boli schopní vysterilizovať. Ako náhradu za pevný uzáver môžeme použiť parafilm.  "Umývanie riadu" je bežná "laboratórna" činnosť Kultivačné médiá obsahujú všetky látky, potrebné pre rast rastlinného explantátu. Pre ich výživu sú nevyhnutné makrobiogénne a mikrobiogénne prvky, sacharidy ako zdroj energie, vitamíny a rastové regulátory. Zložkou kultivačných médií býva aj myo-inositol. Je to osmoregulátor, teda zabezpečuje v médiu optimálny osmotický tlak. Agar je súčasťou pevných kultivačných médií. Agar médium spevňuje no funkcia agaru je aj absorpčná, viaže niektoré nežiadúce produkty metabolizmu buniek. V niektorých prípadoch sa môžu do kultivačných médií pridávať prírodné produkty nie celkom presne známeho zloženia, ale ich pozitívny vplyv na kultúru bol empiricky overený. Sú to napríklad kokosové mlieko, rozmixovaný banán - do média s klíčiacimi orchideami, proteínové hydrolyzáty, zlúčeniny obsahujúce organický dusík. Podľa konzistencie delíme kultivačné médiá na pevné alebo agarové, s pridaním 6-8 g agaru na liter kultivačného média; polotekuté, so zníženým množstvom agaru; tekuté, bez pridania agaru. Kultúrou na tekutých médiách musíme neustále pohybovať, inak sa rast rastlinných explantátov nedarí. Podľa použitia a pôvodu môžeme rozlíšiť nekonečné množstvo kultivačných médií. Prakticky každý rastlinný explantát potrebuje špecifické zloženie kultivačného média. Aj médiá explantátov odoberaných z jedného listu sa môžu líšiť prinajmenšom v kvantite fytohormónov. Keďže zloženie ideálneho média pre konkrétny explantát je nám neznáme, použijeme niektoré z osvedčených "univerzálnych" médií, ktoré si neskôr môžeme na základe vlastných pozorovaní upraviť. Najbežnejšie používaným kultivačným médiom je MS médium, označené, podobne ako pri ostatných médiách, podľa svojich tvorcov, ktorými boli Murashige a Skoog. Zloženie kultivačného média Základnou zložkou každého kultivačného média sú makrobiogénne prvky: N, P, K, Ca, S, Mg, pričom najviac je potrebný dusík (25-60 µM), zastúpený vo forme nitrátovej aj amónnej. Draslík je potrebný v koncentrácii 20 µM a viac. Mikrobiogénne prvky (Mn, Zn, B, Cu, Mo, Co, Cl, Fe) bývajú v kultivačných médiách zastúpené v stopových koncentráciách. Sacharidy, najmä sacharóza, sú pre kultúru zdrojom energie (uhlíka). Množstvo sacharózy pridávané do médií je 20 g na liter kultivačného média. Ako zdroj energie sa môže použiť aj glukóza, menej vhodná je fruktóza. Myo-inositol sa pridáva do média v koncentrácii 100 mg na liter. Z vitamínov je pre kultúry in vitro nepostrádateľný thiamin (vitamín B1). Dôležitá je kyselina nikotínová (vitamín PP) a pyridoxín (vitamín B6). Niektoré živné pôdy obsahujú biotin a kyselinu pantoténovú. Vo veľmi nízkych koncentráciách sú potrebné aj kyselina p-aminobenzoová, cholinchlorid, riboflavín a kyselina askorbová (vitamín C). Väčšina primárnych explantátov je kultivovaná na pevných kultivačných médiách spevnených agarom. Na jeden liter média sa pridáva 6-8 g agaru. Voda je základom každého kultivačného média. Používa sa destilovaná, alebo redestilovaná. Z rastových regulátorov sú najčastejšie používané auxíny a cytokiníny. Z auxínov je najúčinnejšia kyselina 2,4-dichlórfenoxyoctová (2,4-D). Z iných používaných auxínov je to kyselina α-naftyloctová (NAA), kyselina β-indolyloctová (IAA) a kyselina β-indolylγ-maslová (IBA). Z cytokinínov sa najviac používa kinetín (KIN), benzyladenín (BA), a benzylaminopurín (BAP). Ďalším často používaným rastovým regulátorom je kyselina giberelová (GA3). Tieto fytohormóny sú zároveň zložkami stimulátorov používaných pri zakoreňovaní odrezkov drevín. Prítomnosťou a pomerom fytohormónov v kultivačnom médiu Indukujeme alebo inhibujeme želaný proces v rastlinnom explantáte. Prítomnosť auxínov a ich prevaha nad cytokinínmi indukuje tvorbu koreňov, prevaha cytokinínov indukuje proliferáciu, tvorbu výhonov, vyrovnaný pomer týchto skupín hormónov indukuje nediferencovaný rast, teda tvorbu kalusu. Plant preservative mixture (PPM) je zložkou, ktorá zabraňuje negatívnemu pôsobeniu patogénov na rastlinný explantát, aj keď sa tieto patogény dostanú priamo do kontaktu s explantátom. Táto zložka je v USA komerčnou záležitosťou, no u nás sa vzhľadom na jej vysokú cenu nepoužíva. Príprava kultivačného média Základom prípravy dobrého kultivačného média sú presne navážené jeho jednotlivé zložky. Používame len také chemikálie, ktorých čistota sa blíži 100 %. Najskôr navážime makro- a mikroelementy. Môžeme použiť aj zásobné roztoky. Tieto látky rozpustíme v destilovanej vode. Pomocou pH metra, KOH a HCl upravíme pH na požadovanú hodnotu (5,5). Potom pridáme naváženú sacharózu, rozpustíme ju a pridáme navážený agar, ktorý necháme napučať. Doplníme destilovanou vodou do požadovaného objemu a začneme zahrievať. Zahrievame za stáleho miešania, až kým nie je všetok agar rozpustený. Následne na to pridáme thiamin, prípadne i iné vitamíny a rastové regulátory v presných koncentráciách a médium rozlievame do kultivačných nádob. Nádoby uzavrieme a sterilizujeme pri teplote 121° C a tlaku 1,05 kg/cm2. Sterilizácia kultivačného média prebieha v autokláve alebo v teplovzdušnom sterilizátore. Doba sterilizácie je cca 20 minút. Pri vyššej teplote a dlhšom čase dochádza k intenzívnejšiemu rozkladu agaru, denaturácii vitamínov a fytohormónov. Niektoré vitamíny a fytohormóny preto sterilizujeme filtráciou cez membránový filter. Médium môžeme krátkodobo skladovať v kultivačnej miestnosti, pri dlhodobejšom skladovaní volíme chladničku.  Označené kultivačné nádoby s médiom pred sterilizáciou Pri zavedení rastliny do kultúry in vitro ide o to, ako premiestniť do kultivačnej nádoby živé a vitálne rastlinné bunky bez prítomnosti patogénov, teda húb vírusov a baktérií. Musíme teda odobrať z rastlinného organizmu explantát vovnútri bez patogénov a ten následne povrchovo vysterilizovať bez poškodenia rastlinných buniek a premiestniť do kultivačnej nádoby bez možnosti vniknutia patogénov. Tu je veľmi dôležitý pôvod explantátu. Vysterilizovať listové, stonkové alebo koreňové segmenty či rastový vrchol je oveľa náročnejšie ako rozmnožovacie útvary rastlín s vyvinutou povrchovou ochranou proti negatívnym exogénnym vplyvom. Aseptický výsev semien je teda najjednoduchším spôsobom zavedenia rastliny do podmienok in vitro. Modelový postup aseptického výsevu Sterilizácia semien Semená sterilizujeme zabalené v gáze v 0,2 % roztoku HgCl2. Chlorid ortuťnatý je nebezpečný jed, preto ak je to vhodné, môžeme použiť inú sterilizačnú látku napr.: 10 - 40 % Savo; 5 % chlórové vápno; 2 % chloramin; etanol; ... Doba sterilizácie je cca 5 - 15 minút, podľa použitej látky, jej koncentrácie a štruktúry povrchu i veľkosti semena. Počas doby pôsobenia sterilizačnej látky je vhodné semená v roztoku premiešavať, aby látka rovnomerne pôsobila. Po uplynutí doby sterilizácie semená 3 krát prepláchneme v destilovanej vode a gázové vrecko prestrihneme. Semená menšie ako 0,5 mm boli sterilizujeme v injekčnej striekačke, v ktorej prebieha aj oplachovanie a z nej sú semená rozptýlené na povrch média. Táto činnosť prebieha v laminárnom boxe. Práca v laminárnom boxe Pred začatím samotnej práce vo flow boxe si treba umyť ruky! Tie si ešte pretrieme papierovým obrúskom nasiaknutým sterilizačnou látkou. Otvoríme kultivačnú nádobu, uzáver položíme dnom dolu. Druhou rukou uchopíme pinzetu, ktorá je v nádobe s liehom a opálime ju nad kahanom. Nikdy takúto pinzetu hneď nevkladáme späť do liehu! Zároveň opálime aj okraj kultivačnej nádoby (pokiaľ nie je plastová J). Pinzetu necháme chvíľu vychladnúť, až potom do nej uchopíme semeno a vložíme ho do nádoby. Mierne ho pritlačíme do agarového média, ale musí zostať na povrchu. Dbáme na to, aby sme sa nedotýkali stien nádoby. Pinzetu opäť vložíme do liehu a opálime. Celý postup sa opakuje, až kým nemáme v nádobe požadovaný počet semien. Potom nádobu uzavrieme (označíme fixkou!) a celý postup sa opakuje, až kým nemáme požadovaný počet kultúr. Je vhodné občas preventívne zopakovať sterilizáciu rúk. Po skončení práce v laminárnom boxe jeho priestor upraceme a kultúry prenesieme do kultivačnej miestnosti. Rôzne druhy patogénov sa prejavujú rozdielnymi spôsobmi napadnutia a znehodnotenia kultúry. Najbežnejšia je kontaminácia plesňami. Rastú veľmi rýchlo, sú dobre identifikovateľné a kultúru zničia v priebehu niekoľkých hodín až dní. Pokiaľ ohnisko kontaminácie je mimo explantátu a ten ešte nie je zasiahnutý, je možné ho po opätovnej sterilizácii kultivovať v inej nádobe. Ružový až oranžový lesklý povlak na povrchu média signalizuje bakteriálnu kontamináciu. Takáto kultúra je prakticky odpísaná, baktéria je totiž prítomná aj vovnútri explantátu a jej eliminácia za použitia antibiotík je technicky náročná. Kontaminácia vírusom je najmenej viditeľná, spôsobuje zmeny v štruktúre explantátu, ktoré sú v in vitro bežné a teda nemusia byť odlíšiteľné. Vírusy môže potencionálne obsahovať akákoľvek časť rastliny, nenachádzajú sa iba v meristematickom pletive, ktoré neobsahuje cievne zväzky, po ktorých s vírusy rozširujú. Meristémová kultúra je jediným spôsobom ozdravenia rastliny od vírusu. Zavírená rastlina sa zvyčajne prejaví až po prevedení do podmienok in vivo neprirodzene svetlou farbou, deformovaným tvarom či tvarovými anomáliami a pomalým rastom či odumretím. Pokiaľ sa kontaminácie vyskytujú príliš často, mali by sme pracovať dôkladnejšie, prípadne i zmeniť niektoré postupy práce. Rastlinný explantát (a následne regenerant) je vyživovaný heterotrofne a po prevedení do podmienok in vivo je "odkázaný už len" na autotrofnú výživu. Táto extrémna zmena spolu so zhoršením a destabilizáciou prostredia, i prítomnosťou patogénov je veľmi výrazným stresom, často končiacim odumretím rastliny - regenerantu. Rastlina in vitro nemá vyvinutú kutikulu, preto nemôže regulovať výpar a je nutné ju dlhšiu dobu kultivovať pri vzdušnej vlhkosti blízkej 100 %. Pletivá nie sú prispôsobené na slnečné lúče, svetlo musí byť rozptýlené. Prostredie a hlavne substrát by mal byť prirodzene čistý, vhodný je živý rašelinník. Podľa skúseností sa najlepšie darí prevádzať čo najväčšie regeneranty.  Pinguicula lusitanica po vybratí z nádoby okamžite vädne  Kvitnúca Pinguicula lusitanica in vitro  Hustý "chumáč" Dionaea muscipula in vitro |