Dionaea, Drosera a Pinguicula in vitroMichal Parvanov, 2003
V nasledujúcich riadkoch opisujem svojich pár pokusov s in vitro kultúrou niektorých taxónov mäsožravých rastlín. Za ich realizáciu ďakujem Laboratóriu explantátových kultúr a biomolekulárnych metód (teda hlavne pracovníkom) v Nitre.
Biologické faktory kultivácie Rod Dionaea Kultúra druhu Dionaea muscipula bola založená aseptickým klíčením semien in vitro alebo subkultiváciou z iných in vitro kultúr. Subkultivované boli celé exempláre, kalusy a listové segmenty. Rod Drosera Kultúry rodu Drosera boli založené výsevom in vitro, alebo pasážou z iných in vitro kultúr. Subkultivovaní boli celí jedinci, vrcholové časti rastlín, u hľuznatých rosičiek aj hľuzy. Drosera scorpioides bola zavedená do in vitro podmienok výsevom gemm. Rod Pinguicula Kultúry rodu Pinguicula boli založené výsevom in vitro, alebo pasážou z iných in vitro kultúr. Subkultivovaní boli celí jedinci, listové a koreňové segmenty. Hybrid Pinguicula x Sethos x gypsicola bol zavedený do kultúry pomocou povrchovo vysterilizovaných listov zimnej ružice. Chemické faktory kultivácie Pletivá a jedinci boli kultivovaní na médiách podobného zloženia, Murashige-Skoog (MS) a Linsmaier-Skoog (LS). Médium LS sa od MS odlišuje neprítomnosťou glycínu, kyseliny nikotínovej a pyridoxínu, ale obsahuje vyššie množstvo thiamínu. Mäsožravé rastliny sú v spotrebe biogénnych látok úsporné, preto boli niektoré kultúry kultivované na médiách s polovičným obsahom týchto látok. Obsah myo-inositolu ako osmotického regulátora a agaru ako látky, spevňujúcej médium bol plný. Pri požiadavke cieleného zásahu do diferenciácie explantátu boli použité rastové regulátory. V konkrétnych prípadoch to bola kyselina naftyloctová (NAA), kyselina 2,4-dichlórfenoxyoctová (2,4-D), 6 benzylaminopurín (BAP) a kyselina ß-indolyloctová (IAA). Predpokladaný účel hormónov je uvedený v tabuľke 1.
Fyzikálne faktory kultivácie Kultivačné nádoby boli umiestnené v kultivačnej miestnosti pri hustote ožiarenia 10,2 - 14,5 W.m-2. Nastavená fotoperióda je 16/8, teda v priebehu 24 hodín boli explantáty vystavené 16 hodín svetlu a 8 hodín v tme. Ako zdroj osvetlenia sa používajú žiarivky Osram L56W/20. Teplota, pri ktorej rastliny vegetovali bola 20° C. Relatívna vzdušná vlhkosť interiéru kultivačnej miestnosti sa pohybuje medzi 20 a 80 %, v závislosti od osvetlenia. V jednotlivých nádobách bola rôzna hodnota pH. Štandardne sa pohybovala od 5,5 do 6,0, pre tučnice, ktoré v prírodných podmienkach rastú na alkalických substrátoch bola hodnota pH upravená na základe hypotézy na 7,0 s cieľom sledovania kvality rastu. Zavádzanie pletív do kultúry in vitro prebiehalo aseptickým výsevom semien alebo pomocou povrchovo vysterilizovaných vegetatívnych častí rastliny. V laminárnom aseptickom boxe boli semená vložené do 0,2 % roztoku HgCl2 alebo 40 % Sava na dobu od 5 do 15 minút, podľa typu osemenia a veľkosti semena. Počas doby pôsobenia sterilizačnej látky boli semená v roztoku premiešavané, aby látka rovnomerne pôsobila. Následne boli semená tri krát prepláchnuté v sterilnej destilovanej vode a uložené na povrch agarového média. Semená menšie ako 0,5 mm boli sterilizované v injekčnej striekačke, v ktorej prebiehalo aj oplachovanie a z nej boli semená rozptýlené na povrch média. Podobným spôsobom prebiehala aj povrchová sterilizácia rastlinných pletív, listy hybridu Pinguicula x Sethos x gypsicola, zberané zo zimnej ružice, veľké 5 mm, boli sterilizované 10 minút v 30 % Save. Gemmy druhu Drosera scorpioides boli sterilizované 5 minút v 30 % Save. Celé rastliny Dionaea muscipula priemeru 8 mm boli sterilizované 10 minút v 30 % Save. Pracovalo sa s tepelne vysterilizovanými pomôckami. Zavedenie druhu do kultúry in vitro Založenie in vitro kultúry druhu Dionaea muscipula prebiehalo rôznymi spôsobmi (tab. 2). Po sterilizácii celých rastlín (kultúra číslo 1), približne 1 cm veľkých, následne po zavedení do in vitro kultúry kontaminoval, čo dokazuje, že 10 minútová sterilizácia v 30 % Save je pre celé rastliny nedostatočná. Ako optimálny spôsob zakladania in vitro kultúry mucholapky sa javí aseptický výsev semien. Semená po 10 minútach v 40 % Save boli dostatočne vysterilizované a nebola zaznamenaná žiadna kontaminácia. Klíčivosť čerstvých semien je blízka 100 %. Embryo má os a dva zelené klíčne listy, pravidelného tvaru. Klíčenie je epigeické, klíčny koreň je čierny, štíhly, predĺžený s koreňovými vláskami. Hypokotyl a epikotyl nie sú rozoznateľné. Listy sú zelené, pravidelného tvaru. Rast klíčnych rastlín je v porovnaní so subkultivovanými jedincami kvalitnejší. Tvoria kompaktné, zdravo pôsobiace listové ružice s dokonalejšie vyvinutými pascami. Rastliny, dlhodobo kultivované v in vitro podmienkach, tvoria často deformované listy tmavšej, neprirodzenej farby s nesprávne vyvinutými pascami, ale z hľadiska propagácie, je pozitívnym javom ich spontánne delenie trsov.
Vplyv koncentrácie kultivačného média Podľa pozorovania jednotlivých kultúr, je z kvalitatívneho hľadiska vhodnejšie kultivovať explantáty na médiách s polovičným obsahom biogénnych prvkov (tab. 3). Jedinci, kultivovaní na médiu s plným obsahom biogénnych prvkov boli deformovaní, ich poškodenia boli porovnateľné s rastlinami v substrátoch s vysokým obsahom dusíkatých látok.
Vplyv pH Optimálne pH média je 5,6, médium s hodnotou pH=7 pletivá netolerujú (tab. 4).
Vplyv rastových regulátorov, ich koncentrácie a kombinácie Na médiu bez rastových regulátorov bol u subkultivovaných rastlín zaznamenaný spontánny delivý rast a tvorba trsov. Diferenciácia pletív u subkultivovaného kalusu neprebiehala. Pridanie auxínu (NAA) do média spôsobilo zintenzívnenie tvorby koreňov. Korene vyrastajú i s koreňového segmentu. Avšak z listového segmentu vyrastajú výhony. Rozdiel medzi koncentráciou 0,5 mg/l a 2,0 mg/l nebol pozorovateľný. Pridanie 0,3 mg/l BAP a 0,1 mg/l NAA do polovičného MS média spôsobuje zintenzívnenie rastu, ale kvalita rastlín sa znižuje. Vyššia dávka BAP spôsobila v kultúre s 1,5 mg/l BAP a 0,1 mg/l NAA ešte väčšie deformácie, teda je možné predpokladať, že sa so zvyšujúcou koncentráciou cytokinínov zvyšuje rýchlosť rastu na úkor kvality. Rastliny na médiu s 0,5 mg/l BAP rástli pomalšie, ale rany po rezoch sa zahojili, teda je možné predpokladať, že druh Dionaea muscipula reaguje na určitú koncentráciu BAP tvorbou kalusu, z ktorého následne vyrastajú výhony, aj keď sa predpokladala priama tvorba výhonov. Pridanie 4 mg/l NAA a 4 mg/l 2,4-D do média LS spôsobuje tvorbu kalusu, v tomto prípade sa predpoklad potvrdil (tab. 5).
 Dionaea muscipula in vitro Zavedenie druhov do kultúry in vitro Zakladanie in vitro kultúr rodu Drosera je vhodné robiť aseptickým výsevom (tab. 6). Keďže sú semená rosičiek malé, až takmer prachové, na sterilizáciu a výsev sa používa striekačka. 30 % Savo a 5 minútová doba sterilizácie sú vhodné na založenie výsevu in vitro. Klíčivosť je veľmi dobrá. Embryo má os a dva klíčne listy. Klíčenie je epigeické. Klíčny koreň je čierny, štíhly, predĺžený s koreňovými vláskami. Hypokotyl je predĺžený (do 10 mm). Klíčne listy sú zelené, pravidelného tvaru. Epikotyl nie je rozoznateľný. Vegetačný vrchol so základmi listov nie je chránený listami, ktoré sú pravidelné, zelené. Nevyklíčenie druhov Drosera filiformis a Drosera rotundifolia (kultúry číslo 2 a 4) mohlo byť spôsobené nedostatočnou stratifikáciou semien.
Vplyv koncentrácie kultivačného média Podľa pozorovania jednotlivých kultúr, je z kvalitatívneho hľadiska vhodnejšie kultivovať explantáty na médiách s polovičným obsahom biogénnych prvkov (tab. 7). Plné kultivačné médium dobre znášajú druhy hľuznatých rosičiek. Jedinci iných ekologických skupín, kultivovaní na médiu s plným obsahom biogénnych prvkov, boli deformovaní, ich poškodenia boli porovnateľné s rastlinami v substrátoch s vysokým obsahom dusíkatých látok. 2/3 jedincov druhu Drosera scorpioides (kultúra číslo 6) odumreli s podobnými vonkajšími prejavmi ako jedinci tohto druhu odumierajú pri vysokých teplotách. Vzniká hypotéza, že in vitro kultivácia tohto druhu by mala prebiehať pri nižšej teplote, prípadne na médiu s ešte nižším obsahom biogénnych prvkov a sacharózy. 1/3 jedincov predčasne vytvorila gemmy, čo túto hypotézu podporuje.
Vplyv pH Optimálne pH média je 5,6. Médium s hodnotou pH=7 pletivá netolerujú (tab. 8), rastú deformovane, ale nevylučuje sa jeho uplatnenie pre indukciu variability (kultúra číslo 2 - vznik kristátneho vrcholu).
Vplyv rastových regulátorov, ich koncentrácie a kombinácie Na médiu bez rastových regulátorov bol zaznamenaný štandardný priebeh rastu. Pridanie auxínu (NAA) do média (bez pridania BAP) spôsobilo rastové deformácie s odumieraním kultúr a u hľuznatého druhu Drosera menziesii indukciu tvorby kalusu. Pridanie 0,3 mg/l BAP a 0,1 mg/l NAA do polovičného MS média spôsobuje takisto deformovaný priebeh rastu a tvorbu kalusu, u hľuznatých druhov zintenzívnenie tvorby rastových vrcholov. Vyššia dávka BAP spôsobila v kultúre s 1,5 mg/l BAP a 0,1 mg/l NAA výraznejšiu tvorbu kalusu a rastové deformácie s následným odumieraním, teda je možné predpokladať, že sa so zvyšujúcou koncentráciou cytokinínov znižuje možnosť prežitia explantátu. Prítomnosť auxínu (NAA) sa v prípade s BAP neprejavila ako rozhodujúca. Je teda možné predpokladať, že druhy rodu Drosera sú na prítomnosť rastových regulátorov výrazne citlivé a pre ďalšie experimenty možno odporučiť nižšie dávky. Hľuznaté druhy rosičiek sú pravdepodobne voči rastovým regulátorom adaptabilnejšie.
 Kristátny vrchol Drosera menziesii, kultúra č. 2 Zavedenie druhov do kultúry in vitro Zakladanie in vitro kultúr rodu Pinguicula je vhodné urobiť aseptickým výsevom (tab. 10). Keďže sú semená tučníc malé, až takmer prachové, na sterilizáciu a výsev sa používa striekačka. 40 % Savo a 5-10 minútová doba sterilizácie sú vhodné na založenie výsevu in vitro. Embryo má os a 2 klíčne listy. Klíčenie je epigeické. Klíčny koreň je biely, štíhly, predĺžený s koreňovými vláskami. Hypokotyl nie je rozoznateľný. Klíčne listy sú zelené, pravidelného tvaru. Epikotyl nie je rozoznateľný. Vegetačný vrchol so základmi listov je listami chránený. Listy sú pravidelné, zelené. Kultúru stredoamerických druhov tučníc a ich hybridov je možné založiť zavedením krátkych (5 mm) listov zimnej ružice, sterilizovaných v 30 % Save 10 minút. Zimné listy sú vhodnejšie na sterilizáciu pre ich pevnejšiu, sukulentnú stavbu a tým i väčšiu odolnosť voči agresívnym látkam. U druhov tvoriacich hibernaculum (Pinguicula vulgaris) je možné vysievať nezrelé semená a v tomto prípade nie je nutné semená pred výsevom stratifikovať ako pri štandardných výsevoch i v podmienkach in vivo. Nevyklíčenie druhu Pinguicula bohemica mohlo byť spôsobené nedostatočnou stratifikáciou semien.
Vplyv koncentrácie kultivačného média Pri kultúrach rodu Pinguicula bol zaznamenaný rozdielny vplyv koncentrácie kultivačného média na klíčne a subkultivované vzrastnejšie rastliny (tab. 11). Na plnom kultivačnom médiu je možné kultivovať iba starších jedincov, semená ihneď po vyklíčení prestávajú tvoriť listy a začína rast kalusu. Kalus je vodnatý, u niektorých druhov kompaktný, bezzrnitý, s lesklým povrchom, žltý so zelenou, žltou alebo hnedou mozaikou. Nepravidelného tvaru, rozptýlený plošne na médiu. Intenzita rastu kalusu je nízka. Diferenciáciu iného pletiva sa z kalusu indukovať nepodarilo. Na médiu s polovičným obsahom biogénnych prvkov sa klíčne rastliny vyvíjali typicky, jedinci druhu Pinguicula lusitanica dokonca bohato kvitli.
Vplyv pH Preukázala sa relatívne vysoká tolerancia tučníc k hodnote pH. Rast druhu Pinguicula primuliflora bol intenzívny na médiu s hodnotou pH=7, jedinci dokonca kvitli. Ostatné druhy rástli bez viditeľných rozdielov na médiách s hodnotami pH od 5,58 do 6,0. Vplyv rastových regulátorov, ich koncentrácie a kombinácie Rod Pinguicula je podľa pozorovaní výrazne citlivý na obsah rastových regulátorov v kultivačnom médiu. Väčšina variantov médií s hormónmi spôsobila odumretie explantátu. Pre ďalšie experimenty preto možno odporučiť médiá s nižším obsahom rastových regulátorov. Pridanie 0,5 mg/l NAA spôsobilo zintenzívnenie tvorby koreňov, ktoré vyrastali i s koreňových segmentov.
 Pinguicula lusitanica počas pasážovania rýchlo zasychala  Zakvitnutá Pinguicula lusitanica in vitro  Deformovaný kvet Pinguicula primuliflora na rastline čerstvo prevedenej z in vitro (zhrnutie) Zakladanie in vitro kultúr skúmaných druhov mäsožravých rastlín je najvhodnejšie prostredníctvom aseptického výsevu semien. Okrem mexických tučníc, ktorých zimné listy sukulentnej ružice sú dostatočne odolné voči agresívnej sterilizačnej látke, v konkrétnom prípade 10 minútovému pôsobeniu 30 % Sava. Pre celých jedincov druhu Dionaea muscipula je však takáto sterilizácia nedostatočná, s vysokou pravdepodobnosťou preto, lebo sterilizačná látka sa nedostane ku zhusteným bázam listov, kde sa, samozrejme, patogény takisto nachádzajú. Semená druhov mäsožravých rastlín sú sterilné po 5-15 minútovom pôsobení 40 % Sava. Gemmy trpasličích rosičiek stačí ošetriť 5 minút v 30 % Save. Použitie HgCl2, pre vysoké ohrozenie človeka touto látkou, je nevýhodné, keďže Savo ho môže dobre nahradiť. Všetky pozorované skupiny mäsožravých rastlín preferujú kultivačné médiá s polovičným obsahom biogénnych prvkov, čo vyplýva nielen z pozorovania, ale i logicky z ich nárokov na životné prostredie, kde je predovšetkým nedostatok dusíkatých látok. Na médiách s plným obsahom sa explantáty deformujú, klíčne rastliny európskych druhov tučníc tvoria iba kalus. Naopak americké druhy druhej ekologickej skupiny nezávisle dobre rastú na plných i polovičných médiách. Takmer všetky pozorované druhy mäsožravých rastlín preferujú hodnotu pH blízku 5,6. Jedine niektoré druhy tučníc (Pinguicula primuliflora, Pinguicula x Sethos x gypsicola) prosperujú aj na neutrálnom médiu (pH=7). Vyplýva to takisto z prírodných podmienok, v ktorých tučnice rastú na vápencových podložiach. Najväčšie rozdiely medzi jednotlivými skupinami mäsožravých rastlín sú v reakciách na rastové regulátory. Tieto látky z pozorovaných druhov najlepšie znáša Dionaea muscipula. (S výnimkou hybridu Pinguicula x Sethos x gypsicola, ktorý na prítomnosť 0,5 mg/l viditeľne nereaguje.) Rosičky a tučnice reagujú na ich prítomnosť citlivo, často odumretím. Z rosičiek sú voči použitým dávkam tolerantné iba hľuznaté druhy piatej ekologickej skupiny. Tučnice (s výnimkou hybridu Pinguicula x Sethos x gypsicola) po aplikácii rastových regulátorov spravidla odumierajú. Je možné, že v prírodných podmienkach je ich endogénna hladina fytohormónov veľmi nízka. Z hľadiska mikropropagácie mäsožravých druhov rastlín, nie je prítomnosť rastových regulátorov podmienkou. Delivý rast a tvorba rastových vrcholov sú u väčšiny druhov spontánne. Vo všeobecnosti možno povedať, že pridanie 0,5 mg/l NAA do kultivačného média indukuje u mäsožravých rastlín tvorbu koreňov. Pri vyššej dávke NAA (2,0 mg/l) vegetovala len Dionaea muscipula. Obsah 0,3 mg/l BAP a 0,1 mg/l NAA spôsobuje deformácie. Náznak predpokladanej tvorby vegetačných vrcholov bol pozorovaný iba u druhu Pinguicula lusitanica. Obsah 1,5 mg/l BAP a 0,1 mg/l NAA spôsobuje deformácie aj u mucholapky. Na prítomnosť 0,5 mg/l BAP predpokladane reagujú len hľuznaté rosičky. Predpokladaná reakcia na obsah 4 mg/l NAA a 4 mg/l 2,4-D, teda indukcia tvorby kalusu, bola pozorovaná len v prípade druhu Dionaea muscipula. U tohoto druhu bolo pozorované nasledovné špecifikum. Kultúry, ktorých pôvod bol z prestarnutých kultúr, majú tendencie k odumieraniu a rastovým deformáciám. Najlepší vývin bol zaznamenaný u priamych klíčnych rastlín. Tvoria kompaktné, zdravo pôsobiace listové ružice s dokonalejšie vyvinutými pascami. Rastliny, dlhodobo kultivované v in vitro podmienkach, tvoria často deformované listy tmavšej, neprirodzenej farby s nesprávne vyvinutými pascami. Niekedy môže spontánne vzniknúť kalus. Práve tieto kultúry podnecujú predpoklad vzniku spontánnych fenotypovo sa prejavujúcich odchýlok. Pre zachovanie kvalitnej kultúry tohto druhu však možno odporučiť likvidáciu prestarnutých kultúr a sporadické zakladanie nových kultúr výsevom semien. |