Vplyv trávenia na život rastlinných bičíkovcov (Phytoflagellata) v pasciach mäsožravých rastlínAndrej Pavlovič, Trifid 2/1999, 3&4/2000
Trávenie mäsožravých rastlín je bezpochyby nesmierne zaujímavé. Vo svojom článku, ktorý je skrátenou verziou biologickej olympiády, sa pokúšam zistiť, aký vplyv má trávenie na výskyt jednoduchých bičíkatých rias (Phytoflagellata) v pasciach mäsožravých rastlín. Nie je však pasca ako pasca. Výskum bol zameraný na gravitačné pasce, tj. tie, ktoré lapajú korisť do rôzne džbánkovito premenených listov. Vďaka stálemu objemu tráviacej tekutiny sa s nimi lepšie pracuje. Zameral som sa na druhy Cephalotus follicularis (tento rok zakvitol opäť, takže podmienky opísané v TRIFIDe 3+4/1998 sa zdajú byť ideálne), Sarracenia purpurea subsp. purpurea, Nepenthes madagascariensis a iné druhy rodu Nepenthes. Cephalotus a Nepenthes majú svoje krčiažky pomerne dobre chránené viečkom. To ich chráni pred možným prístupom dažďovej vody (výnimku tvoria N. inermis a N. ampullaria). Z tohoto dôvodu nemôže prísť k zrieďovaniu tráviacej tekutiny nahromadenej v pasciach. Druh S. purpurea však žiadne viečko nemá, a preto nič nebráni prístupu dažďovej vody. Táto rastlina má ešte k tomu ďalšie špecifikum. Produkcia enzýmov rastlinou je veľmi malá. U tohto druhu som zámerne udržiaval vodnú hladinu do 1/3 pasce. Po tomto úvode by som pristúpil ku konkrétnym cieľom:
1. Zistiť, ktoré zo skúmaných rastlín sú schopné meniť pH tráviacej šťavy počas trávenia. 2. Zistiť, ako vplýva množstvo natrávenej koristi a pH na populáciu rias.  Meranie pH, ilustračný obrázok K bodu 1: Trávenie je proces, pri ktorom sa makromolekulové organické látky (napr. bielkoviny) štiepia pomocou enzýmov na organické látky s menšími molekulami (napr. aminokyseliny). Enzýmy sú katalyzátory. Katalyzátory sú látky, ktoré urýchľujú priebeh chemických reakcií. Je všeobecne známe, že existujú faktory, ktoré dokážu urýchliť rýchlosť enzýmových reakcií. Sú to: teplota, koncentrácia substrátu (substrát je látka, ktorá vstupuje do reakcie), prítomnosť aktivátorov a inhibítorov, iónová sila, redoxný potenciál, pH. Budeme sa zaoberať predovšetkým pH. Hodnota pH je pre každý enzým špecifická (napr. pepsín - pH 1.5-2.5, trypsín - pH 7.8-8.6). Pri danej optimálnej hodnote je daný enzým najaktívnejší. Existencia optima pH súvisí s tým, že enzýmy ako proteíny sú látky s elektrickými nábojmi a priestorové usporiadanie ich makromolekúl závisí veľmi od hodnôt jednotlivých nábojov, ktoré sú pri rozličných koncentráciách vodíkových iónov rozdielne. Optimum pH znamená, že táto koncentrácia vodíkových iónov je optimálna pre vznik väzby medzi enzýmom a substrátom, pretože pri ňom sú funkčné skupiny aktívneho centra alebo substrátu v najvhodnejšom disociačnom stave pre väzbu. V knihe M. Studnička: Masožravé rostliny, Academia 1984, je uvedené, že mäsožravé rastliny po polapení koristi upravujú hodnotu pH prostredia od pH 6.5 až na pH 3. Táto skutočnosť je uvedená na konkrétnom príklade Nepenthes x Coccinea. Nie som si istý či možno tieto hodnoty zovšeobecniť. Nemenné pH počas trávenia by sa dalo predpokladať u druhu S. purpurea s voľnou hladinou tráviacej tekutiny a minimálnym množstvom vylučovaných enzýmov. Táto hypotéza sa aj potvrdila. Prekvapením bolo pre mňa meranie pH u Cephalotusu, ktorý zrejme - ako sa zdá - nie je schopný pH meniť i napriek tomu, že v pasciach sa nachádza čisto tekutina vylučovaná rastlinou a nedochádza k jej zrieďovaniu. U rodu Nepenthes sa výsledky M. Studničky potvrdili. Tento rod v priebehu trávenia okyslil tráviacu šťavu až na pH 3. Konkrétny priebeh trávenia možno vyčítať z grafu č. 1, kde na osi x-ovej sa nachádza doba od vhodenia koristi (v dňoch) a na osi y-ovej je pH. Korisťou boli nitenky (Tubifex tubifex) a ucholaci obyčajný (Forticula auriculaha). Merania som robil viackrát obyčajným lakmusovým papierikom. Trávenie je však oveľa chúlostivejší proces, ako by sa nám mohlo zdať. Pravidelné vsúvanie indikátorových papierikov môže rastlinu v pravom zmysle slov priam šokovať. Meranie je preto treba uskutočňovať viackrát a trpezlivo.  Graf č. 1: Hodnoty pH počas trávenia (priemerné z troch meraní) K bodu 2: Na to, aby som mohol zistiť stav populácie rias, zhotovil som si vlastný počítací systém. Vzorku tráviacej šťavy som odobral injekčnou striekačkou. Na podložné sklíčko som kvapol 3 kvapky. Po zakrytí krycím sklíčkom bol preparát pripravený na mikroskopovanie. Počet jedincov jednobunkových rias som zisťoval pri zväčšení 10 x 40, pričom som si na preparáte našiel 5 ľubovolných zorných polí a zhotovil približný priemer. Približný preto, lebo bičíkaté riasy sú schopné aktívneho pohybu a zle sa počítajú. Takto som zistil stav populácie. Postupne ako sa pasca vyvíja, objavuje sa v nej tráviaca tekutina (okrem S. purpurea). Akonáhle sa viečko zdvihne nad otvor pasce, táto je schopná loviť. Pri odobratí práve z takejto pasce som zistil nulový stav populácie. Potom som do pascí vhodil približne rovnakú korisť a sledoval stav každých 24 hodín. Už po 48 - 72 hodinách bolo možné pozorovať jednobunkové bičíkaté riasu u druhov C. follicularis a S. purpurea. Neskôr som pozoroval ich nepriateľov, ktorí ich požierali (črievička a iné). U rodu Nepenthes som nespozoroval prítomnosť ani jednej riasy. V tej dobe bola už tráviaca šťava značne kyslá (pH = 3). Napadlo ma, že práve kyslosť môže byť limitujúcim faktorom ich výskytu. Ióny vodíka, ktoré sú vlastne zodpovedné za kyslé pH, môžu mať na živé organizmy priam toxický účinok. O tom, že pH je limitujúcim faktorom, som sa presvedčil jednoduchým pokusom. Na podložné sklíčko som kvapol bohatú populáciu bičíkatých rias. Potom som pridal kyselinu citrónovú tak, že výsledné pH bolo 3 - 4. V priebehu pár sekúnd riasy v pohybe ustali. O pár hodín sa vo vzorke nenachádzali už ani ich telíčka. Podobne to dopadlo, ak som ku vzorke prikvapol tráviacu šťavu z Nepenthesu, ktorej pH bolo 3. Pridanie tráviacej šťavy z krčiažka Nepenthesu, ktorý netrávil (pH 6 - 7), riasam vôbec neuškodilo. Pri trávení sa v pasciach udržuje veľké množstvo voľných organických látok. Rastliny sú však autotrofné organizmy, čo znamená, že organickú hmotu si budujú z anorganických látok. Existuje však zopár špecialistov (patria medzi ne i niektoré druhy bičíkatých rias), ktoré - ak im to prostredie poskytne - sa môžu vyživovať i heterotrofne. Túto schopnosť majú pravdepodobne i pozorované riasy. Po skončení trávenia u druhov C. follicularis a S. purpurea rapídne poklesol výskyt rias, ale nikdy načisto nevymizol. Množstvo bičíkatých rias možno pozorovať na grafe č. 2, kde na osi x sú dni od vhodenia koristi a na osi y priemerné množstvo rias v zornom poli pri zväčšení 10 x 40. Z uvedených výsledkov vyplýva, že množstvo organických látok, ktoré vznikajú pri trávení, je priamo úmerné počtu rias, a že pH tráviacej šťavy je pre ich populáciu priam toxické. I keď som spomínal, že mikroorganizmy sa v pasciach rodu Nepenthes nevyskytujú, je možné, že ich tam môžete nájsť. Nájdete ich tam v prípade, keď bola rastlina vystavená rôznemu stresu a počas trávenia nebola schopná roztok okysliť. Takýto stav môže skutočne nastať. Je zaujímavé, že oba organizmy (mäsožravá rastlina aj bičíkovec) sú mixotrofné. Ťažko povedať, či ich vzájomný vzťah možno považovať za symbiózu či parazitizmus. Rád by som uvedené pokusy vyskúšal i na rodoch Heliamphora a Darlingtonia. Darlingtonia má však veľmi komplikovanú stavbu pasce a odoberanie vzoriek z takejto pasce by iste narušilo prirodzený priebeh trávenia. Rod Heliamphora zatiaľ nepestujem. Myslím si však, že u oboch rodov by sa trávenie približovalo druhu Sarracenia purpurea.  Graf č. 2: Počet bičíkatých rias počas trávenia (stĺpec Nepenthes sp. splýva s osou x) V prvej časti článku som sa venoval vplyvu deficitu zrážok na stav populácie v pasciach. V druhej by som sa rád venoval taxonomickému zaradeniu rias. 1) Testovanými rastlinami v prvej časti môjho projektu boli: Cephalotus follicularis, Sarracenia purpurea subsp. purpurea a Nepenthes sp. Pretože rody Cephalotus a Nepenthes majú pasce chránené viečkom a sú si sebestačné pri vylučovaní štiav, je zrejmé, že nedostatok zrážok nebude mať príliš veľký vplyv na stav tekutín v pasciach. Iná je situácia pri S. purpurea, ktorá pasce nemá chránené viečkom a keby bola odkázaná sama na seba, v jej pasciach by sa vodná hladina nikdy neutvorila, pretože korisť tráviacimi šťavami iba zvlhčí. Okruh testovaných rastlín sa teda zredukoval na jednu: S. purpurea. Pojem nedostatok zrážok je u mňa relatívny, pretože u mňa nie sú rastliny vystavené atmosférickým zrážkam a za stav vodnej hladiny zodpovedám ja. V nasledujúcich riadkoch popíšem ako sa to všetko udialo. Sarracenia purpurea počas vegetačnej sezóny 1999 rástla voľne na okennom parapete. V dôsledku zisťovania vplyvu trávenia na život rastlinných bičíkovcov (TRIFID 2/1999) boli dospelé rastliny pomerne dobre prikrmované, pričom sa v pasciach viackrát vytvorila bohatá populácia rias. Vodnú hladinu v pasciach som počas vegetačnej sezóny udržiaval približne do 1/3 pasce. Približne v strede novembra som rastliny premiestnil do pivnice, kde sa teplota v zime pohybuje od 5 - 15° C. Bližšie som o pestovaní S. purpurea v bytových podmienkach písal v TRIFIDe 3+4/1997. Rastliny v pivničných priestoroch upadli do dormancie. Úplne zastavili rast a niektoré zo starších listov začali postupne od vrchu odumierať. Vo všetkých pasciach som postupne nechal vyschnúť tekutinu. Začiatkom februára 2000 som rastliny umiestnil opäť na okenný parapet. Počas zimy polovica listov odumrela. Živé ostali asi cca 3 na jednu rastlinu. Ak som niektorý z týchto listov rozrezal, pozoroval som, že ich vnútorná stena je pokrytá jemnou šupinovitou blankou, prípadne v niektorých pasciach tiež slizovitým útvarom. Oba pozorované útvary sa nachádzali iba v pasciach, ktoré počas vegetačnej sezóny trávili, a teda sa v nich vytvorila populácia bičíkatých rias. Pasce som opäť napustil do 1/3 vodou a v priebehu asi troch dní som už pozoroval jednoduché bičíkaté riasy. Podobne dopadol i skúmavkový pokus, pri ktorom som odobral spomínané šupinovité a slizovité útvary, ktoré som potom umiestnil do skúmavky a zalial vodou. Vodný stĺpec bol asi 1 cm vysoký. Bičíkatých rias však bolo pomerne málo, asi 1 až 2 kusy (viac o metodike počítania v prvej časti môjho článku). Bolo to pravdepodobne preto, že vnútorné prostredie pasce bolo pre mixotrofné bičíkovce pomerne chudobné. A aký je teda záver? Ako je možné, že rastlinné bičíkovce prežili takmer dvojmesačné vyschnutie pasce a na jar sa počas priaznivých podmienok v priebehu troch dní opäť vyskytli v pasciach s tekutinou? Odpoveď je jednoduchá. Mnohé jednobunkovce sú schopné počas nepriaznivých podmienok vytvárať odpočinkové štádiá, v ktorých môžu nepriaznivé podmienky prežiť. Týmito odpočinkovými stavmi boli pozorované šupinovité útvary. Podobnú schopnosť majú zrejme i pozorované bičíkovce. Dokiaľ som nekozultoval s odborníkmi nebol som schopný povedať, či pokojovým štádiom je akineta, aplanospóra alebo cysta. V týchto odpočinkových štádiách môžu ostať v pokoji alebo sa v nich môžu i množiť. Pomocou cýst sa tiež môžu transportovať na väčšie vzdialenosti (napr. vetrom v prachu z vyschnutých vôd). Tento primárny spôsob šírenia môže byť tiež prvotnou príčinou výskytu bičíkovcov v mladých pasciach. Sekundárne sa sem môžu dostať s korisťou. Z uvedených výsledkov však jednoznačne vyplýva, že rastlinné bičíkovce sú schopné prežiť dočasné vyschnutie tekutín v pasciach. Sú toho schopné nielen počas dormancie, ale s najväčšou pravdepodobnosťou i počas horúcich, suchých letných dní. Po obnovení pôvodných podmienok sú schopné sa tu znova objaviť. 2) Nedávno sa v TRIFIDe objavili články RNDr. Lubomíra Adamca a Prof. Jiřího Komárka o Euglénach v pasciach niektorých druhov bublinatiek (Utricularia sp.). Bičíkaté riasy, ktoré som pozoroval ja, pravdepodobne Euglény nie sú, pretože na rozdiel od Euglén sú viac-menej guľatého tvaru, a nie vretenovité, či podlhovasto valcovité. Za taxonomické zatriedenie riasy ďakujem za nezištnú pomoc predovšetkým Doc. RNDr. Františkovi Hindákovi, DrSc. z Botanického ústavu SAV. Docentovi Hindákovi sa podarilo zatriediť riasu na úroveň rodu. Pre obraznosť uvádzam celé taxonomické zaradenie: Ríša: Rastliny (Rostliny) - Plantae Podríša: Nižšie rastliny (Nižší rostliny) - Thallobionta Oddelenie: Chromofyty (Hnědé řasy) - Chromophyta Trieda: Žltohnedé riasy (Zlativky) - Chrysophyceae Rad: Bičíkaté žltohnedé riasy (Bičíkaté zlativky) - Chrysomonadales Rod: Ochromonas Do oddelenia chromofytov patria riasy, ktoré majú prevahu karotenoidov nad chlorofylom A, na rozdiel od zelených rias, kde je tento pomer opačný chlorofyl B chýba. Podľa kvantitatívneho zastúpenia jednotlivých pigmentov sa chromatofory (chromatofor - plastid obsahujúci asimilačné farbivá v rôznych kombináciách, no vždy bez chlorofylu B) rozlične zafarbujú od žltej, cez žltohnedú, bledozelenú, hnedú, ojedinelo modrastú alebo červenkastú. Riasy s prevládajúcim pohyblivým štádiom tohto oddelenia (resp. triedy žltohnedé riasy), patria do radu Chrysomonadales. Rod Ochromonas je charakteristický dvoma bičíkmi, ktoré sú nerovnako dlhé, pričom hlavný bičík je niekoľkokrát taký dlhý ako vedľajší. Hlavný bičík má na povrchu jemné vlásnenie a nazýva sa perovitý. Vedľajší je hladký. Zásobnou látkou je polysacharid chrysolaminarín v podobe veľkého zrna alebo viacerých menších zŕn. Môžu mať stigmu (stigma - svetlocitlivá organela charakteristická u rias s monádoidnou (bičíkatou) stielkou, riasy sa potom prejavujú pozitívnou fototaxiou - pohyb za svetlom). Bunky nie sú chránené bunkovou stenou ako je to u väčšiny rastlín, ale periplastom (periplast - vonkajšia vrstva cytoplazmy, zastávajúca funkciu bunkovej steny u bezblanných rastlín). Periplast je hladký a jemný. Pozorovaný Ochromonas mal jednu chromatoforu. Jeho bunky boli jednotlivé, guľaté (menlivé), voľne plávajúce. Rozmnožujú sa priečnym delením v pohyblivom štádiu. Pri delení sa najskôr zdvoja chromatofory, potom bičíky. V tomto štádiu to vyzerá ako keby mala bunka až štyri bičíky. Posledné sa rozdelí jadro. Pozorované boli nepohyblivé slizovité štádiá. Má schopnosť vytvárať cysty. Sú schopné mixotrofného spôsobu výživy a to buď osmotrofne alebo zootrofne. Taxonomické určovanie žltohnedých rias je náročné na pozorovaciu techniku. Zle viditeľné sú veľmi jemné bičíky (najmä kratší bičík) a nevýrazné sú často aj iné bunkové organely napr. pulzujúce vakuoly alebo stigma. Je prakticky nemožné, aby sa v pasciach okrem bičíkatých rias nevyskytovali i iné organizmy. Časté sú rôzne nálevníky. Túto rastovú sezónu sa v pasciach premnožilo oveľa viac nálevníkov, než sezónu minulú. Je ich tu možno viac než samotných bičíkatých rias. Tento jav si zatiaľ neviem vysvetliť. Vnútri nálevníkov je možné pozorovať prítomnosť asimilačného farbiva, preto možno predpokladať, že sa živia týmito riasami. Iná je možnosť symbiotického spolužitia medzi rastlinným a živočíšnym organizmom. Z baktérií som napríklad pozoroval nepohyblivé tyčinky. Z rias, na ktoré evidentne množstvo organických látok, ktoré pri trávení vznikajú, nijak nevplývalo, sú rozsievky (Bacillariophyceae) a to rod Achnantes. Prítomná bola tiež kokálna riasa Pseudococomyxa adhaerens z radu bunkových zelených rias (Chlorococcales), či Scenedezmus. Rod Ochromonas som mal možnosť u docenta Hindáka pozorovať na vlastné oči. V čase, keď som mu priniesol vzorku s bičíkatými riasami, som z tej istej pasce asi o 3 dni skôr poslal vzorku do Botanického ústavu AV ČR RNDr. Lubomírovi Adamcovi do Třebone. Vzorku mi vyhodnotil RNDr. Jaromír Lukavský. Následne asi o týždeň som obdržal telefón od pána Adamca, že riasa bola identifikovaná ako Protomonadales (bičíkovce neistého systematického zaradenia). Malo sa jednať o rody Hexamithus alebo Urophagus. Bol som pomerne prekvapený, keď som sa to dozvedel, pretože Protomonadales sú tzv. bezfarebné bičíkovce a ja som u pána Hindáka farebné chromatofory jednoznačne videl. Rody Hexamithus a Urophagus majú až 8 bičíkov, pričom 3 páry sú rovnako dlhé, plávacie, zasadené v blízkosti apexu a jeden pár je vlečný. Vyskytujú sa v silne znečistených vodách. Jediným možným vysvetlením, že sa tu ocitli, bolo to, že počas transportu vzorky došlo k zmene biologickej diverzity vo vzorke. Transport vzorky trval 5 dní poštou v malej plastovej skúmavke s objemom asi 1,5 ml. Vzorka bola v tme, čo mohlo spôsobiť ústup fotoautotrofných organizmov (teda rod Ochromonas) a nástup organizmov heterotrofných (teda Hexamithus alebo Urophagus). Pokusne som si to vyskúšal. Odobral som vzorku, pevne som ju uzavrel v malom objeme a umiestnil do tmy. O 5 dní som vzorku skontroloval. Nastal ústup rodu Ochromonas a premnoženie neznámeho, rýchle sa pohybujúceho organizmu. S mojim školským mikroskopom som však nebol schopný daný organizmus identifikovať. Použitá literatúra: Hindák František et al. - Sladkovodné riasy - SPN, Bratislava, 1978 Škárka Bohumil, Ferenčík Miroslav- Biochémia -Alfa, Bratislava, 1987 Studnička Miloslav - Masožravé rostliny - ČSAV, Praha, 1984 Svrček Mirko a kol. - Klíč k určování bezcévných rostlin - SPN, 1976 |